| |
Главная
|
Выявление хемотаксических факторов. МетодикаМатериалы и оборудование Для работы необходима камера для хемотаксиса из пиакрила (полиметилметакрилат) с внешним диаметром 15 мм и внутренним 14 мм. Составные части камеры для хемотаксиса
На рисунке выше показаны составные части камеры: корпус с внутренней резьбой и держателем для мембраны, 2 мембраны, уплотнительное кольцо, верхняя камера с резьбой. Нужно иметь также нитроцеллюлозные мембраны диаметром 12 мм (Sartorius, ФРГ). Для исследования мононуклеаров диаметр пор мембраны должен составлять 5—8 мкм, нейтрофилов — 3 мкм. Размер пор непроницаемой для лейкоцитов мембраны 0,3—0,45 мкл. Получение клеток Наиболее часто индикаторными клетками служат КПЭ кролика или морской свинки, а также лейкоциты крови человека. Обогащенный гранулоцитами экссудат (95—99% нейтрофилов) получают внутрибрюшинным введением 100 мл стерильного бульона (25 г питательного бульона на 1 л дистиллированной воды, Институт иммунных препаратов и питательных сред, Берлин) с последующей через 24 ч пункцией брюшной стенки и промыванием брюшной полости. Обогащенный макрофагами экссудат (50—80% макрофагов) получают на 5—7-й день после внутрибрюшинного введения вазелинового масла кролику (100 мл) или морской свинке (20 мл). Клетки трижды отмывают раствором Хенкса или средой Игла при 5—10°С. Лейкоциты крови человека в зависимости от целей исследования используют в виде тотального препарата или выделяют отдельные типы .клеток. Например, нейтрофилы и моноиуклеары получают разделением в градиенте плотности по Бейюму (см. раздел "Определение клеточных маркеров методом мембранной иммунофлюоресценции"). Нейтрофилы используют в виде суспензии 2—Зх106 клеток/мл, макрофаги — 4—5х106 клеток/мл. К суспензии клеток добавляют либо сыворотку (100—150 мл/л), либо 10—20 г/л сывороточного альбумина. Хемотаксис В нижнее пространство камеры вносят 1 мл исследуемого материала или контрольной среды. в качестве примера мы рассмотрим определение хемотаксических свойств бесклеточной надосадочной жидкости, полученной из стимулированной культуры лимфоцитов. Мембрана с промигрировавшими гранулоцитами крови человека
Хемотаксический агент — надосадочная фракция культуры
активированных лимфоцитов, После заполнения нижнюю камеру закрывают непроницаемой для клеток мембраной, стараясь избежать образования пузырей воздуха. Сверху кладут вторую мембрану, проницаемую для лейкоцитов, и фиксируют винтовым запором. в верхнее пространство вносят 1 мл клеточной суспензии, закрывают камеру покровным стеклом для предотвращения испарения. Инкубируют камеры при 37—39 °С. Продолжительность инкубации нейтрофилов составляет 3 ч, мононуклеаров — 5 ч. По окончании инкубации жидкость из верхней камеры отсасывают, убирают мембраны и, пометив верхнюю и нижнюю стороны, аккуратно ополаскивают физиологическим раствором, через 3 мин фиксируют 96% этзиолом. Окрашивание можно производить 1% метиленовым синим (10 мин). Количественную оценку проводят путем подсчета мигрировавших клеток на обеих мембранах. Просматривают по 10 полей зрения на нижней поверхности верхней мембраны и на верхней поверхности нижней мембраны. Учитывают только те клетки, которые полностью прошли через верхнюю мембрану. Подсчитывают среднее количество клеток в поле зрения в двойных пробах. Для достоверности результатов следует учитывать спонтанную миграцию (контроль с чистой культуральной средой). Рассматривают либо разность значений стимулированной и спонтанной миграции, либо их отношение. Для сценки хемокинетического эффекта исследуемую субстанцию вносят в верхнюю и нижнюю камеры. О наличии хемотаксического эффекта говорят в тех случаях, когда миграция клеток, обусловленная градиентом концентрации, выше, чем в отсутствие градиента. |
