Главная

• Антитела
• Реакция антиген-антитело
• Клетки иммунной системы
• История иммунологии
• Иммунохимия
• Продукты на страже иммунитета
• Вакцины
• Общие и частные проблемы иммунологии
• Основы иммунологии

Определение растворимых иммунных комплексов. Методические варианты

В 1976—1981 гг. было описано около 40 различных тест-систем. Это позволило провести в рамках международных исследований сравнение 18 различных методов определения иммунных комплексов. Только 6 из них оказались пригодными в отношении точности, специфичности, чувствительности и воспроизводимости результатов. Вместо широко применявшихся ранее физических методов в настоящее время чаще используют биологические.

Методы определения растворимых иммунных комплексов, не основанные на антигенной специфичности

Физические

1. Гель-фильтрация 2. Центрифугирование в градиенте плотности 3. Криопреципитация 4. Осаждение ПЭГ

Биологические

Бесклеточиые системы, взаимодействие с: 1. Комплементом 2. Конглютинином 3. Ревматоидным фактором Системы с использованием клеток: 1. Взаимодействие с Fc-рецепторами 1.1. Проба на агрегацию тромбоцитов 1.2. Торможение АЗКЦ 1.3. Тест торможения активности макрофагов 2. Взаимодействие с С-рецепторами: тест с клеточной линией Raji 3. Взаимодействие с протеином А

Осаждение пэг

Метод основан на различной растворимости мономеров иммуноглобулин в составе иммунных комплексов при наличии в среде полиэтиленгликоля (ПЭГ) 6000. Исследуемые сыворотки хранят при 4°С после добавления 0,02% азида натрия. Сыворотки разводят 0,1 М боратным буфером (рН 8,4) в соотношении 1 :24. К 4 мл разведенной сыворотки добавляют равный объем 7% раствора полиэтиленгликоля 6000 в 0,1 М боратном буфере и выдерживают смесь при 4°С в течение 18 ч. После центрифугирования при 20 000 g в течение 20 минут осадок 1 раз отмывают 3,5% раствором ПЭГ, затем растворяют его в 5 мл 0,1 М NaOH. Содержание белка определяют по Лоури или по оптической плотности при длине волны 280 нм. В нормальных сыворотках преципитаты не дают значений оптической плотности более 0,12. Оценка результатов: как и в случае ультрацентрифугирования, гель-фильтрации и криопреципитации, положительный ответ можно дать только после дополнительного определения IgG или Clq в сыворотках или преципитатах. Этот метод, широко применяемый в лабораториях, подвергся в последнее время критике, авторы даже объявили метод совершенно непригодным. Они полагают, что полиэтиленгликоля следует применять только для получения иммунных комплексов. которые в дальнейшем будут подвергнуты более детальному иммунохимическому анализу.

Тест на связывание clq

Антитела (IgG 1, 2, 3 и IgM), входящие в состав иммунных комплексов, и обладающие свойством связывать Clq, можно легко обнаружить при помощи Clq, меченного ¹²⁵[I]. Выделение иммунных комплексов со связанным ¹²⁵[I]-Clq проводят в присутствии 2,5% полиэтиленгликоля 6000. Сlq с сохраненной реактивностью получают из сыворотки человека, используя Н2О2 и лак-топероксидазу. Применяемый для анализа препарат должен обладать специфической активностью около 1 мкКи/мкг. Если он разделен на аликвоты по 10 мкКи и хранится при —70 °С, его можно считать пригодным для работы в течение 6 нед. Перед употреблением 10 мкКи ¹²⁶[I]-Clq смешивают с 5 мл веронал-NaCl буфера (рН 7,2, 1% БСА) и центрифугируют в течение 40 мин при 18 ООО g. Из надосадочной фракции отбирают пробы по 50 мкл (около 0,1 мкКи) в каждую пробирку. К 50 мкл исследуемой сыворотки добавляют 100 мкл раствора ЭДТА (0,2 МЭД'ГА рН 7,5) и инкубируют 30 мин при 37 °С. После охлаждения смеси до 0°С к ней прибавляют 50 мкл ¹²⁵[I]-Clq и 1 мл 3% раствора полиэтиленгликоля (30 г полиэтиленгликоля 6000 в 1 л 0,1 М НзВОз, 0,025 М тетраборат Na, 0,075 М NaCl, рН 8,3). Пробиркам со смесью дают постоять 60 минут и центрифугируют их в течение 20 мин при 1500 g, надосадочную фракцию отсасывают и отбрасывают, измеряют радиоактивность. Полученное значение радиоактивности относят к количеству ¹²⁵[I]-C[I]q, осаждаемому 1 мл 20% ТХУ. Ранее для уменьшения неспецифической преципитации ¹²⁶[I]-Clq применяли прогревание сывороток в течение 30 минут при 56 °С. Использование ЭДТА позволяет повысить чувствительность метода до 50 мкг, а также предотвратить как переход в иммунные комплексы Clq-связывающих компонентов из сыворотки, так и распад существующих иммунных комплексов.

Стандартная кривая, построенная с использованием термоагрегированного v-глобулина, 7S-IgG

Суспензия в нормальной сыворотке в присутствии ЭДТА.
1 — в нормальной сыворотке; 2 — в сыворотке, прогретой при 56°С; 3 —7S-IgG в нормальной сыворотке

Оценка получаемых результатов: использование термоагрегированного человеческого IgG в качестве стандарта позволяет повысить чувствительность метода до 50 мкг, однако это не всегда бывает достаточно. Особое внимание следует уделять чистоте препаратов Clq. Присутствующий в них в качестве примеси IgG может соединяться с ревматоидным фактором и симулировать наличие иммунных комплексов. Потенциально с Clq могут также связываться ДНК, гепарин, различные полисахариды и фибриноген.

Твердофазный анализ с использованием clq

Адсорбированный на твердую фазу Clq сохраняет способность связываться с Fc-концом IgG 1, 2, 3 и IgM, входящих в состав иммунных комплексов. Использование твердой фазы позволяет сравнительно просто удалять компоненты, не связывающие Clq. Адсорбция достигается инкубацией в течение 3 дней при 4°С пластиковых пробирок с 1 мл раствора Clq (10 мг человеческого Clq в 1 л ФСБ рН 7,2; 0,01 М Na₂HP0₄, 0,15 М NaCl). Пробирки трижды ополаскивают холодным ФСБ и инкубируют с ФСБ, содержащим 0,1% раствор желатина. Затем проводят троекратное ополаскивание ФСБ, после чего пробирки готовы к использованию (их можно хранить в холодильнике). К 50 мкл исследуемой сыворотки добавляют 100 мкл 0,2 М ЭДТА рН 7,5, инкубируют смесь в течение 30 мин при 37 °С. После охлаждения до 0 °С отбирают аликвоты различных разведений сыворотки объемом 50 мкл, смешивают их с 950 мкл 0,05% раствора твин-20 в ФСБ (ФСБ-твин) и вносят в «сенсибилизированные» Clq пробирки, которые затем инкубируют 1 ч при 37 °С и еще 30 мин при 4 °С. Несвязавшийся материал удаляют 3—4-кратным ополаскиванием 1,5 мл ФСБ-твина, ¹²⁵[I]-IgG человека в количестве 1 мкг, содержащего специфические антитела (около 0,25 мкКи/мл), растворяют в 1 мл ФСБ-твина, вносят в пробирки и инкубируют их в течение 1 ч при 37 °С, затем еще в течение 30 мин при 4 °С. После удаления ¹²⁵[I]-АТ измеряют радиоактивность твердой фазы. Неспецифическое связывание ¹²⁵[I]-антител проверяют на пробирках, «нагруженных» только желатином. Если вместо желатина использовать БСА, а концентрацию твин-20 повысить до 0,1%, то неспецифическое связывание уменьшается до такой степени, что им можно пренебречь. Связывание Ig человека с адсорбированным Clq в области концентраций 0,1—10 мкг носит в отсутствие мономерного IgG линейный характер.

Связывание агретированного человеческого IgG с Clq, адсорбированным на пластиковых пробирках

Меченный ¹²⁵[I] агрегированный IgG вносили в различных концентрациях, степень связывания определяли после отмывки.

В присутствии 25 мкл нормальной человеческой сыворотки этим методом удается выявить 1 мкг Ig человека; показатель связывания выходит на плато при 25—50 мкг Ig человека.

Определение агрегированного IgG в присутствии 25 мкл нормальной сыворотки человека

Оценка получаемых результатов. Как упоминалось выше, чувствительность метода на модели Ig человека составляет 1 мкг/мл. По сравнению со связыванием Clq (меченным ¹²⁵I) в жидкой фазе становятся весьма заметными искажения, вносимые составными частями сыворотки, не относящимися к иммунным комплексам. Применяемый для работы Clq не должен содержать примесей иммуноглобулинов. Отсутствие иммуноглобулин следует устанавливать методом ИЭФ с моно- и полиспецифическими АС. Было предложено использовать в качестве твердой фазы пластиковые шарики, при этом отмечалось снижение количества адсорбируемого Clq на 10%, что существенно снижало издержки анализа. Другим вариантом твердофазного связывания с Clq может стать применение энзим-меченных антител. Использование в анализе класс-специфических АТ (антитело) позволяет отдифференцировать IgG от IgM в составе иммунных комплексов. Хорошим индикатором может стать ¹²⁵[I]-протеин А, заменяющий ¹²⁵[I]-IgG против АГ человека.

Связывание иммунных комплексов со стафилококком А

Клеточные системы для количественной оценки связывания растворимых иммунных комплексов можно разделить на две группы в соответствии с задействованными клеточными рецепторами. В тесте с использованием линии клеток Raji—это рецепторы типа C3(b, d). Тромбоциты, макрофаги или К-лимфоциты связывают растворимые иммунные комплексы за счет Fc-рецепторов. При постановке клеточных проб Fc-рецепторного типа основное значение приобретает избирательное связывание IgG, входящего в состав иммунных комплексов, но не мономерного IgG. Описана индикаторная система, в которой первичным агентом связывания служат инактивированные нагреванием клетки Staphylococcus aureus, штамм Cowan I. Содержащийся в их наружной мембране протеин А обладает селективными свойствами по отношению к Fc-рецепторам.

Подготовка стафилококков. Штамм Cowan I после культивации инактиви-руют нагреванием в течение 2,5 мин при 80 °С и хранят при —70 °С. После оттаивания микробные клетки остаются пригодными для работы в течение 4 недель. Для постановки пробы используют 0,8% (по объему) суспензию микробов вбычьий сывороточный альбумин— ФСБ (0,5% БСА, 0,01 М Кг НР0₄, 0,15 М NaCl, 0,1% NaN₃, рН 7,2).

Индикаторная система. Для количественной оценки растворимых комплексов 50 мкл человеческой сыворотки смешивают с 150 мкл ЭДТА-буфера (0,2 М натриевая соль ЭДТА, рН 7,4), затем добавляют 1 мл 6% раствора полиэтиленгликоля 6000 в 0,1 М боратном буфере (см. выше). Пробирки с пробами оставляют на ночь при 4 °С, затем центрифугируют их 20 мин 1000 g. Каждый осадок ресуспендируют в 1 мл 5% раствора ПЭГ и снова центрифугируют. На этом этапе удаляется мономерный IgG. Надосадочную фракцию сливают, осадок растворяют в 200 мкл ФСБ; добавляют при комнатной температуре аликвоту объемом 100 мкл к такому же объему суспензии стафилококков и инкубируют 2 ч при 37 ^СС. Связывающиеся в этих условиях с протеином А иммунные комплексы после предварительного добавления к смеси 0,5 мл 0,5% раствора БСА—ФСБ осаждаются вместе с микробами центрифугированием при 1000 g в течение 10 мин. Перед последующей обработкой пробирки выдерживают некоторое время при 0—4 °С. Осадки дважды отмывают БСА— ФСБ и растворяют в 100 мкл ФСБ, содержащего 5 мг/мл IgG кролика. Определение связавшихся иммунных комплексов проводят при помощи 100 мкл препарата меченных ¹²⁵[I] кроличьих антител к IgG человека (0,04 мкКи/мкг). Для постановки этой пробы необходим избыток меченых AT. Меченые антитела титруют клетками золотистого стафилококка, нагруженными человеческим IgG. Реакцию индикации проводят приблизительно в течение 12 ч при 4 °С, непрореагировавшие антитела остаются в надосадочной фракции после центрифугирования в течение 10 мин при 1000 g. Осадок трижды отмывают ФСБ, затем измеряют радиоактивность. При измерениях, проводимых с Ig человека в пределах 0—200 мкг, стандартная кривая имеет линейный характер; обработка осадка поливалентными ¹²⁵[I]-анти-IgG-антителами приводит к высокому, почти 50% уровню неспецифической сорбции, вследствие чего стандартная кривая приобретает уплощенный вид.

Стандартная кривая определения агрегированного глобулина в присутствии нормальной сыворотки человека

Для реакции применяли меченный ¹²⁵[I] IgG человека (1) или поливалентные специфические антитела (2).

Оценка результатов. Метод не подвержен искажениям со стороны клеточных процессов и сывороточных антител в отличие от тест-систем, использующих живые клетки (тест агглютинации тромбоцитов, тест с линией клеток Raji, тест торможения активности макрофагов). Будучи комплементнезависимым методом, он позволяет получать результаты, которые не зависят от содержания комплемента в сыворотке. К недостаткам метода следует отнести то, что он применим к иммунным комплексам, содержащим только IgG. Чувствительность по Ig человека составляет 10 мкг/мл и почти не зависит от степени агрегации белка.